孔雀石绿酶联免疫检测试剂盒使用说明书
1. 用途
孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，又名碱性绿、严基块绿、孔雀绿，其既是杀真菌剂，又是染料，易溶于水，溶液呈蓝绿色。长期以来，渔民都用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿。研究显示，孔雀石绿在鱼内残留时间太长，且其具有高毒性、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用，鉴于此，许多国家均将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。我国于2002年5月也将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中。目前检测孔雀石绿的方法有两种：HPLC或GC-MS，但是其前处理步骤繁琐，费用昂贵。酶联免疫检测试剂盒则可经济、快速地检测鱼、虾、以及鱼池或者鱼缸水样中的孔雀石绿残留。
本试剂盒采用竞争酶标免疫法定量测定鱼、虾、以及鱼池或者鱼缸水样中的孔雀石绿残留。
2. 测定原理
孔雀石绿检测试剂盒是利用免疫学竞争法的原理，固相载体微孔板上包被有孔雀石绿蛋白偶联物，加入待测孔雀石绿标准品或样品溶液及特异性的抗孔雀石绿抗体，包被在微孔板上的孔雀石绿蛋白偶联物和标准品或样品中的孔雀石绿竞争性地与抗体结合；再加入酶标二抗, 形成抗原抗体复合物；洗涤后加入显色剂，结合的酶将无色的显色剂转化为蓝色的产物；加入反应终止液后使颜色由蓝色变为黄色；在450nm波长进行检测，样品中的孔雀石绿浓度与吸收光强度成反比。
3. 试剂盒组成
96孔酶标板：1块（包被有偶联抗原12X8）。
标准品贮备液（Standard）: 1瓶（0.8ml/瓶），81ug/ml。
标准品稀释液：1瓶（12ml）。
酶标记物：1瓶（10倍, 1.8ml）。
浓缩抗体：1瓶（10 倍, 0.9ml）。
抗体稀释液：1瓶（8ml）。
显色剂A：1瓶（8ml）。
显色剂B：1瓶（8ml）。
终止液：1瓶（8ml）。
浓缩洗涤液：1瓶（10倍， 50ml/瓶）,用于酶标记物的稀释和酶标板的洗涤。
样本稀释缓冲液：1瓶（4ml）
提取液A浓缩液：1瓶（5 倍 ，45ml/瓶）
提取液B浓缩液：1瓶（2倍，21ml/瓶）
中性柱层析氧化铝，100-200目，1瓶
氧化液：1瓶（4 ml）
使用说明书
4. 需要但试剂盒中不提供的器材和试剂
（1）设备
…微孔板酶标仪(450nm)
…均质器
…振荡器
…离心机
…20μl, 200μl，1000μl微量移液器
…5ml, 10ml移液管
…50ml塑料离心管
…氮吹仪或旋转蒸发仪
（2）试剂
…二氯甲烷（分析纯）
…乙腈（分析纯）
…无水硫酸钠（分析纯）
…正己烷（分析纯）
5. 注意事项
（1）终止液为2M硫酸，避免接触皮肤
（2）不要使用过了有效日期的孔雀石绿检测试剂盒，不同批次、不同试剂盒之间的试剂等内容不可混用，以免降低灵敏度。
（3）0标准液的A450nm<0.6时，表示试剂可能变质，请勿使用。
（4）显色剂变蓝，表明已变质，请勿使用。
6. 储存条件
2-8℃保存，切勿冷冻。
将不用的酶标板放进原袋中重新密封。
酶标记物和显色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7. 样品处理
鱼/虾样品的准备（稀释倍数1.2）
a) 鱼虾去皮取肉，用匀浆器均质样品;
b) 称取2.5g均质好的样品，放入50ml离心管中，加入稀释好的提取液A（稀释方法：取1ml 提取液A浓缩液，加4ml蒸馏水）5mL，搅匀。加入乙腈7.5 mL，用振荡器剧烈振荡5分钟，3000转／分离心 5分钟，取上清，放入50ml离心管中。于残渣中加入5mL乙腈，重复上述操作，离心后移取上清，合并于上述离心管。
C)加入5mL正己烷，在振荡器上剧烈振荡5分钟，静置分层，移取下层（乙腈－水层）到一个50ml离心管中；在离心管中加入5mL正己烷，振荡后静置，移取下层（乙腈－水层）到另一个50ml离心管中。
d)向该溶液加入稀释好的提取液B 1mL（稀释方法：取1ml 提取液B浓缩液，加1ml蒸馏水）和二氯甲烷5mL，用振荡器振荡5分钟，3000转／分离心 5分钟，移去下面的水层。 在余下的液体中加入2.5克的无水硫酸钠，不时振荡混合，放置 15分钟。移取液体层, 在50℃下，用氮气吹干或旋转蒸发仪蒸干。
e)加入0.265ml乙腈，在涡旋仪上充分涡旋5分钟，加入35μl氧化液，涡旋2分钟，放置20分钟，加入100mg中性层析氧化铝，充分涡旋1分钟；
f) 取上层25μl，加入50μl样本稀释缓冲液，175μl蒸馏水，混合均匀，3000转／分离心 5分钟，取50μl作ELISA分析。
（2）水质样品（稀释倍数1.43）
取水样175μl, 加入50μl样本稀释缓冲液, 25μl乙腈，取50μl作ELISA分析。
8. 免疫分析时试剂的准备
（1）注意事项
a) 使用之前将所有试剂回升至室温。
b) 使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。
c) 在使用中不要让微孔干燥。
d) 在EIA分析中的重复性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是EIA测定程序中的要点。
在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。
（2）浓缩洗涤液，使用前应根据所需量进行10倍稀释，即按1ml浓缩洗涤液加入9ml蒸馏水的比例进行稀释。
（3）抗体应用液：按照1：10稀释（1μl浓缩抗体加9μl抗体稀释液）。在吸取浓缩抗体之前，要仔细地振摇，剩余的放置于2-8℃保存。每次抗体应用液应即配即用。
（4）酶标记物应用液：按照1：10稀释（1μl酶标记物加9μl稀释好的洗涤液）。在吸取浓缩液之前，要仔细地振摇，剩余的放置于2-8℃保存。每次酶标记物应用液应即配即用。
（5）标准品的配制：取7个1.5ml离心管,标为1到7号,分别加入495, 495, 400, 400, 400, 400, 400μl标准品稀释液, 按照下表配制标准品.如 5μl标准品贮备液加入1号管,与495μl标准品稀释液混匀，制备成810ng/ml孔雀石绿标准液。取5μl 配好的810ng/ml孔雀石绿标准液, 加入2号管, 与495μl标准品稀释液混匀，制备成8.1ng/ml孔雀石绿标准液。取200μl 配好的8.1ng/ml孔雀石绿标准液, 加入3号管, 与400μl标准品稀释液混匀，制备成2.7ng/ml孔雀石绿标准液。依次稀释，制备成8.1、2.7、0.9、0.3、0.1、0ng/ml的标准液，（见下表）。标准液现配现用。
取7个1.5ml离心管编为1，2，3，4，5，6，7
管号 标准品稀释液 (μl) 孔雀石绿标准液浓度（ng/ml）
1 495 5ul标准品贮备液 810
2 495 5ul 1号液 8.1
3 400 200ul 2号液 2.7
4 400 200ul 3号液 0.9
5 400 200ul 4号液 0.3
6 400 200ul 5号液 0.1
7 400 0
9. 测定程序
将标准液、样品所需微量反应板（均需2个平行试验）放在反应架上。
每孔注满稀释好的浓缩稀释液，轻轻振荡，放置2分钟，弃去孔中液体，并在吸水纸上拍干，重复1次。
加入50μl的标准液或处理好的样品到各自的微孔板中。
加入50μl已稀释的抗体应用液加入微量反应板，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，37℃下反应30分钟。
弃去孔中液体，并将微孔板剩余残液在吸水纸上拍干。每孔注满稀释好的浓缩稀释液，轻轻振荡，放置2分钟，弃去孔中液体，并在吸水纸上拍干，重复4次。
加入100μl酶标记物应用液到微孔板中，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后， 37℃下反应30分钟。
弃去孔中的液体，并在吸水纸上拍干，每孔注满稀释好的浓缩稀释液，轻轻振荡，放置2分钟，弃去孔中液体，并在吸水纸上拍干，重复4次。
显色试剂以1：1混合后加入100μl到微孔中，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，在37℃暗处孵育15分钟。
加入50μl终止液到微孔板中，混合好在450nm处测量吸光度值，必须在加入停止液后10分钟内读取光度值。
10. 结果
所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准（0标准）的吸光度值再乘以100，因此0标准等于100%并且以百分比的形式给出吸光度值。
标准的吸光度值（或样品）
-----------------------------------×100 = %吸光度值
0标准的吸光度值
计算的标准值绘成为一个对应孔雀石绿浓度（ng/g,或ng/ml）的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在0.1—2.7ng/g(ppb)范围内应当成为线性。相对应每一个样品的浓度（ng/g, 或ng/ml）可以从校正曲线上读出。
注意：在计算结果时，所得浓度值需乘以系数；如鱼/虾样品的稀释倍数为1.2，所得浓度值需乘以系数1.2。
11. 灵敏度
孔雀石绿检测试剂盒对于鱼/虾样品的检测限约为0.5ng/g（0.5ppb），对于水质样品的检测限为0.1ng/ml(0.1ppb)。
12. 特异性
与孔雀石绿类似物的交叉反应：
孔雀石绿 100%
结晶紫 91%
隐性孔雀石绿 0.4%
隐性结晶紫 <0.01%
13. 回收率
回收率为90%±15%
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孔雀石绿酶联免疫检测试剂盒
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